SUGESTÕES E NORMAS PARA AS AULAS PRÁTICAS –
NORMAS DE BIOSSEGURANÇA
Nas aulas práticas de Microbiologia e imunologia trabalha-se com uma
variedade de bactérias, algumas patogênicas para o homem. É essencial
seguir as normas de segurança estabelecidas para um Laboratório de
Microbiologia, a fim de evitar uma contaminação dos estudantes,
professores e funcionários.
- Use um jaleco para proteger sua roupa;
- Os horários de aula deverão ser obedecido com rigor, tendo uma tolerância máxima de 15 min.
- É obrigatório o uso de jaleco e sapatos fechados para assistir as aulas práticas, pois além de proteger a roupa, condiciona o aluno à limpeza e disciplina;
- Antes de começar a trabalhar
no Laboratório, leia o protocolo ou roteiro das técnicas. Procure
compreender os princípios fundamentais de cada um;
- Cada prática deverá ser
iniciada com breve explicação e instruções. Quando não entender o método
ou a finalidade de algum experimento, pergunte;
- Anote cuidadosamente todas as observações;
- O Laboratório deve ser um recinto calmo. Evite falar em voz alta e sair desnecessariamente de seu lugar;
- Limpe a bancada com algodão umedecido com desinfetante, antes e depois dos trabalhos;
- Sendo alguns dos
microrganismos patogênicos em potencial, é necessário desenvolver
técnicas de assepsia ao manejá-los. Evite o contato da boca com as mãos,
e atitude como fumar, comer ou umedecer as etiquetas com a língua. Após
terminar o trabalho prático, lave as mãos com água e sabão;
- As alças e agulhas de
repicagem devem ser flambadas antes e após a sua introdução nas placas e
tubos de cultura. Estes deverão ser s flambados após a retirada da
rolha e, também, antes de recolocá-la;
- Os meios de cultura semeados
devem ser devidamente identificados (data, grupo e sala) e mantidos
sobre a mesa para que os técnicos possam levá-los para a estufa;
- Após o uso, lâminas,
lamínulas e pipetas devem ser colocadas em recipientes apropriados, com
solução desinfetante, os quais se encontram sobre as mesas;
- Não coloque material contaminado nas pias;
- Ao lidar com vidros, cuidado para não quebrá-los e nem se cortar;
- Leia com atenção os rótulos dos frascos antes de utilizar as substâncias que eles contêm;
- Antes de qualquer observação
microscópica, verifique as condições em que se encontra o microscópio
(abertura do diafragma, posição do condensador, objetivas, oculares,
etc.,). Após o uso, limpe as lentes com lenço de papel;
- Lavar as mãos ao sair do Laboratório e sempre que suspeitar de contaminação;
- Cuidado ao acender o bico de gás (bico de Bunsen). Verificar se não existem substâncias inflamáveis por perto;
- Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso;
- Avisar ao professor em caso de contaminação acidental.
- Identificar adequadamente o material de trabalho.
- Utilize o laboratório
somente quando estiver realizando as práticas. Não risque as bancadas. O
aluno deverá encontrar seu lugar limpo e assim deixá-lo para o colega
seguinte. Se observar algo errado comunique ao professor para que ele
possa tomar as devidas providências. Limpe seu lugar quando terminar o
trabalho;
- Quando aquecer uma substância em tubo de ensaio, não aponte a extremidade livre para si nem para outra pessoa;
- Substâncias inflamáveis devem ser aquecidas em banho-maria ou chapa elétrica;
- Não atire material usado
descuidadamente na pia, principalmente lâminas e lamínulas. Depois de
usado, todo o material deve ser reposto no seu devido lugar;
- Ocorrendo qualquer acidente, avise imediatamente ao professor;
- Tome nota de todos os dados e resultados que for obtendo durante a realização da prática;
- Terminada a prática, não deixe material algum sobre as mesas de trabalho;
- É expressamente proibido fumar dentro do laboratório;
- Você irá trabalhar em grupo formado sob seu critério. Portanto escolha bem seus companheiros de trabalho.
- Os assuntos desenvolvidos nas aulas práticas durante o período poderão ser cobrados nas avaliações teóricas.
- Serão exigidos relatórios das práticas realizadas e as questões propostas respondidas
PRÁTICA 1: COLORAÇÃO DE GRAM
Objetivo: Observar formas, disposição e comportamento
tintorial das bactérias. Distinguir bactérias Gram-positivas das Gram-negativas
Princípio: O método de Gram permite classificar as bactérias em dois grandes grupos: as que
retêm Violeta de genciana ( Gram-positiva ) e as que não retém o violeta
genciana (Gram-negativa). Além do mais, é útil para determinar a forma ( cocos
e bacilos ), e o arranjo das células após a divisão celular ( em forma de
cacho, cadeias, sarcina etc., ). As células
bacterianas são caracterizadas morfologicamente:
·
Comportamento
tintorial: Gram-positiva ou Gram-negativa
·
Forma: cocos
(esféricos), bacilos (cilindricos) e espirilos (espiralados)
·
Arranjo:
Disposição das células entre si. Os cocos podem estar isolados, aos
pares(diplococos), agrupados em cachos (estafilococos), em cadeia
(estreptococos). Os bacilos e espirilos se apresentam em geral como células
isoladas porém, ocasionalmente, pode-se
observar bacilos aos
pares (diplobacilos) ou em cadeia ( estreptobacilos ).
Quanto
ao tamanho, as células bacterianas são sempre de dimensões microscópicas, o
diâmetro da maioria delas varia de 0,2 a 1,5 mm e comprimento de 1 a 6 mm.
Material: Reagentes de Gram: sol. cristal-violeta 2%; sol.
aquosa de iodo (Lugol); mistura álcool-acetona; sol. alcoólica de safranina,
Lâminas: Suporte para lâminas; alça de platina; Bico de Bunsen; Microscópio; Óleo de Imersão
Método:
·
Cobrir a área do
esfregaço com a solução de
cristal-violeta por cerca de 1min.;
·
Lavar com água
corrente e escorrer o excesso de água;
·
Cobrir a área do
esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
·
Descorar a lâmina
com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;
·
Cobrir o
esfregaço com a solução de safranina1 por cerca de 30 segundos;
·
Lavar com água
corrente;
·
Deixar secar ao
ar .
REAGENTES PARA COLORAÇÃO DE GRAM
Cristal Violeta
Solução A
Cristal-violeta.......... 2g
Álcool etílico
............ 20 ml
Solução B
Oxalato de amônio ......
0,8g
Água destilada ............ 80
ml
MISTURA A + B
|
Lugol
Iodo
...........................1g
Iodeto de
potássio ...... 2g
água
destilada ...... 300ml
|
Contracorante
Solução estoque:
Safranina 2,5 g / 100ml
Solução uso: Diluir sol.
estoque 1/10
|
|
Interpretação:
As bactérias
Gram-positivas retém o cristal-violeta e se apresentam com coloração violeta,
enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto,
coradas pela safranina e se apresentam róseas.
Comentários:
Em 1884, o médico Dinamarquês Cristian Gram descobriu,
empiricamente, ao corar cortes histológicos com violeta genciana, através do
método de Ehrlich (1882), que as bactérias que eles continham não eram
descoradas pelo álcool, se previamente tratadas com solução de iodo. Ele
adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina básica,
etc.,) e estabeleceu, a partir dai, uma metodologia de coloração diferencial.
Ao longo destes anos, o mecanismo de
coloração de Gram foi sobejamente estudado. E nesta medida, muitas modificações
foram propostas, sem contudo afetar substancialmente a idéia original.
Os microrganismos respondem diferentemente ao método.
Há os que retém o pigmento característico do corante (cristal violeta) em vista
da formação de um complexo com a solução iodo-iodeto (lugol), apesar da lavagem
com álcool ou acetona, motivando uma desidratação da parede celular, diminuição
da porosidade e da permeabilidade. São os Gram-positivos. E há os que permitem
a remoção do pigmento do corante pela lavagem com álcool ou acetona, em
decorrência da extração de lipídios da parede, o que leva a um aumento da
porosidade celular. São os Gram-negativos. Tratando, os dois grupos, com
contra-corante (safranina ou fucsina básica) observa-se que as células do
primeiro (Gram-positivos) não são afetadas e permanecem azuis ou violeta;
enquanto que para o outro (Gram-negativos) as células absorvem o
contra-corante, tornando-as vermelhas.
A parede celular bacteriana
apresenta particularidades na sua composição química. Este dado é absolutamente
coincidente com a resposta à reação de Gram. A presença de maior teor de
peptideoglicano nos Gram-positivos, tem sido apontado como fator determinante
da retenção do complexo ao nível de parede. Tanto assim que os protoplastos,
produzidos por ação de lisozima ou por efeito de penicilina sobre os
Gram-positivos, não são capazes de reter o pigmento, após lavagem com álcool ou
acetona. Portanto, a reação de Gram resulta essencialmente das interações do
complexo, cristal violeta ou violeta de genciana e iodo, com o peptídeoglicano
da parede celular, numa combinação ainda não de todo esclarecida, na qual a
presença de ribonucleato de magnésio é mediadora da fixação do corante.
A reação de Gram tem largo relacionamento com o estado
fisiológico da célula. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação
tintorial. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar como
Gram-variaável, pela perda da capacidade de retenção do corante.
A coloração é hoje empregada com elevado significação
taxonômica. Assim, são Gram-positivos quase todos os bacilos esporulados,
móveis por flagelos peritríquios e a quase totalidade dos cocos. São
Gram-negativos a quase totalidade dos bacilos não esporulados, móveis por
flagelos peritríquios ou polares, e
todas as espiroquetas, apenas para citar alguns exemplos.
Questões
1. A coloração de Gram possibilita caracterizar as
bactérias quanto ao comportamento tintorial (Gram-positiva e Gram-negativa),
morfologia (cocos, bacilos, espirilos) e arranjo (em cacho, em cadeias, aos
pares). Qual o significado destas informações para a medicina?
2. A coloração de Gram exerce alguma importância em
diagnósticos clínicos de bactérias isoladas de infecções humanas e animais?
Citar pelo menos um exemplo.
3. Empiricamente, Gram estabeleceu uma sequência para a
aplicação dos corantes que integram a metodologia. Comentar os resultados
possíveis de serem obtidos com as inversões da sequência referida no método.
4. Sabe-se que se a parede celular é o sítio preferido
pela fixação da reação de Gram. Fazer um esquema mostrando esta associação,
para o caso típico de uma bactéria Gram-positiva.
5. Sendo o Gram um método de coloração diferencial, como
esta reação pode ser empregada para a verificação do estado de pureza de uma
determinada cultura?
6. Comente o efeito da penicilina sobre a parede celular
bacteriana, correlacionando-o com a reação tintorial de Gram.
7. Comente a frase: “Uma bactéria Gram-negativa pode
tornar-se Gram-positiva, dependendo do tempo de incubação da cultura, mas o inverso
não é verdadeiro”.
8.
Os procedimentos realizados estão de acordo com o
protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
9.
Relacione os matérias listados neste protocolo que
não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma
falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
10.
Quais as dificuldades encontradas na realização
dessa prática?
11.
Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com
rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o
professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
12.
Elabore
10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento
das suas dúvidas
Prática 2: Preparo de Meios de Cultura
Objetivo: Familiarizar o aluno com o preparo dos meios de cultura mais usados em microbiologia;
Discutir a aplicação de meios específicos para o cultivo de microrganismos distintos
Princípio:
Os microrganismos, para um crescimento adequado, necessitam de
nutrientes (fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fosfato, etc., ) e
condições ambientais favoráveis (pH, pressão osmótica, temperatura,
umidade, etc., ).
Meios
de cultura são associação qualitativa e quantitativa de substâncias que
permitem o cultivo de microrganismos fora do meio natural. Em condições
naturais, nos diversos “habitats”, os microrganismos ocorrem em
populações mistas. Os meios de cultura permitem isolar os microrganismos
para estudo e pesquisa.
Material:
Peptona, extrato de carne, ágar-agar, ágar Mueller-Hinton, Caldo BHI,
sangue de carneiro desfibrinado, tubos contendo 10ml de ágar-base,
pH-metron, placas de Petri estéreis, pipetas de 1ml estéril, balança,
provetas.
Equipamentos: Autoclave, cronômetro, Banho-Maria a 55ºC
Métodos
Caldo Simples
Peptona.....................5,0g
Extrato de carne ......3,0g
Água destilada .... 1000ml
|
Pesar os ingredientes, dissolver em água destildada e acertar o pH para 7,3. Distribuir em 2ml/tubo. Autoclavar120°C por 15'. Manter em geladeira.
|
Ágar Simples
Ágar.................... 15,0g
Peptona................. 5,0g
Extrato de carne ....3,0g
Água destilada ...1000ml
|
Pesar os ingredientes e dissolver a quente. Acertar o pH para 7,3. Autoclavar 120°C por 15'. Distribuir em placas. Manter em geladeira.
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Ágar Sangue
Adicionar sangue de carneiro desfribinado no ágar nutriente fundido e
resfriado a 55ºC, na proporção de 5%, ou seja, para cada 10ml do ágar
nutriente adicionar 0,5ml do sangue. Homogeneizar e distribuir em
placas.
Ágar Chocolate
Adicionar sangue de carneiro desfribinado no ágar nutriente fundido e
resfriado a 70ºC, na proporção de 5%, ou seja, para cada 10ml do ágar
nutriente adicionar 0,5ml do sangue. Homogeneizar e distribuir em
placas.
Ágar Mueller Hinton
Composição (g/litro)
Infuso de carne .......300g
Casaminoácido .......17,5g
Amido......................1,5g
Ágar .........................17g
pH final 7,3
|
Modo de preparação
Suspender
38,0g em 1000 ml de água destilada ou deionizada e aquecer até ebulição
para dissolver completamente. Esterilizar em autoclave durante 10
min., a 15 Atm pressão (121ºC), esfriar a 50ºC e distribuir em placas
de Petri.
|
Caldo BHI (Brain Heart Infusion)
Composição (g/litro)
Infuso de cérebro de carneiro...200g
Infuso de coração bovino ...... 250g
Peptona proteosa, Difco ......... 10g
Dextrose ................................... 2g
Cloreto de sódio ...................... 5g
Fosfato disódico .................... 2,5g
|
Modo de preparação
Dissolver 37 gramas em
um litro de água destilada ou deionizada. Agitar até completa
dissolução. Esterilizar em autoclave durante 15 minutos a 15 atm.
pH final 7,4
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Comentários
Desde o inicio, os microbiologistas aprenderam que podiam cultivar uma
grande variedade de bactérias em “caldos”, obtidos pela cocção de
tecidos animais ou vegetais. Em 1923, Mueller[1],
tentando definir esta vaga necessidade, em termos de compostos
específicos, descobriu o então desconhecido aminoácido, metionina. A
nutrição bacteriana tornou-se campo dinâmico durante os anos
subsequentes; porém com o reconhecimento da unidade bioquímica, os
vários esquemas nutritivos revelaram ser simplesmente pequenas variações
de um tema central e o estudo da nutrição bacteriana perdeu muito de
seu interesse teórico. Apesar disso, este campo detém sua importância
prática e ainda apresenta desafios; por exemplos, o bacilo da lepra, o
treponema da sífilis e riquétsias não podem ser cultivados em meios
artificiais.
Inicialmente, o único método existente para contagem de bactérias ou
para o isolamento de culturas puras (clones), era a diluição até a
extinção, isto é, até a perda da infectividade. Um progresso importante
foi a introdução dos meios sólidos por Koch. Os materiais usados
inicialmente eram pouco satisfatórios: a superfície da batata cortada
podia permitir um crescimento confluente, enquanto que a gelatina
permanecia sólida apenas em temperaturas relativamente baixas, sendo
liquefeita por muitos microrganismos. Assim sendo, Frau Hesse, esposa de
um médico e bacteriologista amador alemão, introduziu o ágar, um
produto japonês que ela empregava para engrossar as sopas.
O ágar (do malaio “agar-agar”) é um polissacarídeo obtido de certas
algas marinhas (várias algas vermelhas). Constitui-se primariamente de
galactose, com um radical sulfato para cada 10 ou 50 resíduos. O ágar
mostrou-se ideal para formar meios sólidos. Não é tóxico para a
bactéria, e muito poucas conseguem atacá-lo. Em concentrações de 1,5 a 2,0%
apresentam uma superfície úmida para permitir crescimento, mas seca o
bastante para manter separadas as colônias (Excepcionalmente, certos
microrganismos móveis, comoProteus, exigem ágar a 5% para impedir a formação do véu.
Após a fusão entre 80 e 100ºC, as soluções de ágar permanecem líquidas
até 45-50ºC, temperatura que muitas bactérias toleram por alguns
instantes; após a solidificação em temperatura ambiente, permanecem
sólidas até muito acima de 37ºC. A estrutura fibrosa de um gel é
suficientemente compacta para impedir a movimentação de bactérias no seu
interior, mas bastante aberta para permitir a difusão, até mesmo de
nutrientes macromoleculares.
QUESTÕES
- O que são meios de cultura e qual a sua aplicação na prática médica?
- Alguns microrganismos, como Micobacterium leprae, ainda não se conseguiu cultivar em meios de cultura. Quais as possíveis dificuldades e qual a importância desta técnica?
- O que são macronutrientes e micronutrientes ? Cite os principais exemplos
- Qual a função do ágar-ágar na formulação dos meios de cultura?
- Quais as influências da temperatura e tempo de incubação no crescimento bacteriano
- Como se classificam os microrganismos quanto ao D.B.O (Demanda Bioquimica de Oxigênio)?
- O que significa
“crescimento”, quando aplicado a organismos celulares como as bactérias,
e qual o processo de reprodução comumente encontrado nas mesmas?
- Descreva as fases do crescimento de uma célula bacteriana ao se desenvolver em um meio de cultura adequado
- Descreva sobre os principais fatores que interferem no crescimento bacteriano
- Qual a relação que existe entre o requerimento nutricional de um microrganismo e a formulação de meios de cultura?
AUTOCLAVE
VEJA ARTIGO ORIGINAL EM:
A
autoclave é um aparelho muito utilizado em laboratórios de pesquisas e
hospitais para a esterilização de materiais. O processo de autoclavagem
consiste em manter o material contaminado em contato com um vapor de
água em temperatura elevada, por um período de tempo suficiente para
matar todos os microorganismos.
A
autoclave é formada por um cilindro metálico resistente, vertical ou
horizontal, onde geralmente fica a resistência que aquecerá a água (A).
Possui uma tampa que apresenta parafusos de orelhas (B) e permite
fechá-la hermeticamente. Em cima da tampa estão a válvulas de segurança e
de ar (C). Apresenta também uma chave de comando para controlar
temperatura (D) e um registro indicador de temperatura e pressão (E).
AUTOCLAVAGEM PASSO A PASSO
Passo 1: Preparo do material a ser autoclavado
Antes
de autoclavar é necessário preparar o material. As placas de Petri,
espátulas, pipetas devem ser embaladas com papel craft. Frascos com
meio de cultura, água e soluções não devem ser totalmente fechados.
Geralmente é utilizada uma rolha feita de algodão hidrofóbico (que não
molha) e gaze. Essa rolha permite que o vapor entre dentro do frasco e
esterilize a solução. Se o recipiente estiver totalmente fechado não
haverá esterilização. É colocada uma fita adesiva indicadora de
esterilização que mudará de cor após a autoclavação.
Passo 2: Verifique o nível da água.
Adicione
água destilada suficiente para cobrir a resistência, de forma a impedir
a oxidação do metal e danificação da resistência.Coloque o material no
cesto (não coloque mais que um terço do volume do equipamento). Feche a
autoclave, rodando as chaves dispostas. E ligue a autoclave no máximo.
Passo 3:
Atenção: Ao utilizar uma autoclave pela primeira vez, peça alguém que já tenha experiência com este aparelho para te acompanhar.
Então para começar ....
Ligue
a autoclave na chave MAX. Espere até começar a sair um jato de ar
residual e feche a válvula.Depois que fechar a válvula a temperatura e
pressão começarão a subir.
Passo 4
Após
aproximadamente 15 a 20 minutos, quando o registro estiver marcando
121° coloque na temperatura média. A partir desse momento começa a
esterilização. Então deve-se marcar 15 ou 20 minutos, (dependendo do
volume do material). Após esse período a autoclave deve ser desligada.
Atenção: Espere a temperatura abaixar antes de abrir o equipamento.
Retire
o material ainda úmido da autoclave e deixe-o secar à temperatura
ambiente ou em uma estufa. Observe que a fita indicadora mudará de cor.
Para saber mais
Existem
inúmeras técnicas de esterilização. Na indústria os processos mais
utilizados são a esterilização por vapor (autoclave), óxido de etileno e
radiação ionizante. Esses dois últimos são empregados em materiais que
não suportam altas temperaturas, o que acontece na esterilização por
calor úmido. Mas apesar de toda a tecnologia na área da esterilização
muitos hospitais ainda utilizam panelas de pressão para esterilização
dos materiais hospitalares e de forma eficiente as contaminações são
evitadas
Prática 3: Técnicas de semeaduras
Objetivo: Desenvolver as técnicas básicas de semeadura de material para isolamento de germes
Princípio: Uma
população microbiana, sob condições naturais, contém muitas espécies
diferentes. Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e
identificar os microrganismos em uma amostra, para então classificá-los
e caracterizá-los. Os microrganismos na natureza normalmente existem em
culturas mistas, com muitas espécies diferentes ocupando o mesmo
ambiente. Ao determinar as características de um microrganismo, ele deve
estar em cultura pura,
ou seja, em que todas as células na população são idênticas no sentido
de que elas se originaram de uma mesma célula parental. Em laboratório,
os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material nutriente
denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vários fatores :
- Considerações sobre a origem do material a ser analisado
- A espécie que se imagina estar presente nesta amostra
- As necessidades nutricionais dos organismos
Material: Alça
de platina, meio sólido em placa (ágar Mueller-Hinton, ágar sangue,
EMB, etc.,), tubos contendo 10ml de meio Mueller-Hinton, pipetas de
1ml, tubos com 4,5ml de salina estéril, alça de Drigalsky, bico de
Bunsen, swab estéril, galeria para tubos de ensaio, placas de Petri
estéreis, becker de 100ml com álcool, estufa a 37ºC, banho-maria a
100ºC, material biológico (saliva, sec. nasal, sec.ouvido,
sec.orofaringe, fezes, urina, etc.)
Métodos:
Técnica de Esgotamento: A
mais utilizada para isolamento de germes em meio sólido (ágar sangue,
ágar EMB, etc ), onde se utiliza uma alça de platina, previamente
flambada e esfriada
- Com a alça de platina, tocar suavemente na amostra.
- Passar a alça sobre o meio de cultura em movimento de zigue-zague sem sobrepor as linha e sem recarregar a Alça[1].
- Incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas
Espalhamento “Pour Plate”: Consiste
em fazer uma prévia diluição da amostra e colocar em uma placa de Petri
vazia e depois derramar o meio sobre a amostra e agitar para
homogeneizar a amostra diluída com o meio de cultura. Técnica:
- Fazer diluição seriada da amostra, ex. 1/10, 1/100 e 1/1000.
- Colocar 1 ml de cada diluição em uma placa de Petri estéril
- Fundir 10 ml de meio sólido e refriar a 65ºC
- Derramar sobre a amostra na placa e aplicar movimentos suaves na placa para misturar a amostra com o meio;
- Esperar o meio solidificar novamente e incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas
Espalhamento Pós Plate: Consiste em espalhar a amostra diluída ou não sobre o meio com auxilio da alça de Drigalsky, para obter colônias isoladas.
Resultados: Observar as colônias isoladas, caracterizadas pela formação de pontos isolados sobre o meio de cultura, após a incubação.
Recomendações Para Semeadura de Material Biológico
Para
execução de uma boa semeadura, certas precauções especiais devem ser
observadas pelo manipulador, com o fim de preservar a pureza do cultivo e
minimizar os riscos de infecção ou intoxicação no Laboratório:
- Todo
processo deve ser feito em ambiente limpo e desinfetado, próximo de uma
chama “azul” de um bico de Bunsen, ou então dentro de uma câmara de
fluxo laminar;
- Alça de platina utilizada para semear, deve ser flambada antes e depois da semeadura;
- As placas semeadas devem ser incubadas com tampa invertida para não haver transpiração do meio sobre a tampa
- Regular a entrada de ar do bico de Bunsen, para obter uma chama azul ( zona de esterilidade );
- Os tubos ou recipientes com
meios de cultura, estéreis ou com material a ser inoculado, deverão ser
abertos ou manipulados, somente na proximidade da chama do bico de
Bunsen (zona estéril);
- As manipulações devem ser feitas, preferencialmente, por trás da chama do bico de Bunsen.
- As alças ou agulhas, de
platina ou níquel-cromo, devem ser flambadas imediatamente antes e
depois de qualquer transferência. Elas devem ser flambadas em todo seu
comprimento, a partir de alguns centímetros do cabo de Kolle, até ao
rubro, mantendo-as em posição vertical à chama do bico de Bunsen. Nunca
iniciar a flambagem pela extremidade livre da alça ou agulha. Deixar
esfriar nas proximidades da chama;
- Passar, ligeiramente, dentro
da chama do Bico de Bunsen, imediatamente antes e depois da
transferência, pipetas graduadas estéreis, pipeta Pasteur, ou alça de
Drigalsky;
- Nunca abrir ou deixar aberto verticalmente os tubos ou frascos com culturas, incliná-los a aproximadamente em ângulo de 30º;
- No caso de tubo com ágar
inclinado, este deve ficar de preferência na horizontal. Flambar também a
boca dos tubos ou frascos contendo culturas e meios, imediatamente
antes e depois da transferência;
- Nunca depositar a tampa ou tampão de algodão dos tubos ou frascos sobre a bancada ou mesa de trabalho;
- Descartar pipetas usadas em recipientes contendo soluções detergentes ou desinfetantes;
- Tratar de dispor o material
de trabalho em posição adequada à fácil manipulação, sem riscos de
acidentes ou trocas. Manter os tubos, alças e agulhas sempre na posição
vertical, em suportes e estantes apropriadas;
- Identificar adequadamente o material de trabalho.
Conservação das culturas puras
Uma
vez que os microrganismos tenham sido isolados em cultura pura, é
necessário manter as culturas vivas por um período de tempo com o
objetivo de estudá-las. Para armazenar por um período curto, as culturas
podem ser mantidas à temperatura de refrigeradores (4 a 10 oC); Para armazenar por um período longo, as culturas são mantidas em nitrogênio líquido (-196 oC) ou em freezers (-70 a -120 oC), ou ainda congeladas, e então desidratadas e fechadas à vácuo em um processo denominado liofilização
Alguns dos mais usados métodos de conservação:
- Transferência periódica para meios novos
- Sob camada de óleo mineral
- Liofilização
- Congelamento
As
coleções de culturas são bancos de microrganismos e outras células que
estão à disposição de pesquisadores, professores, investigadores de
patentes, e todo aquele que necessite estudar um tipo particular de
microrganismos - um conjunto de células de referência de uma coleção de
cultura padrão. As células são congeladas em cubas de nitrogênio líquido
ou liofilizadas para resistir a qualquer variação que possa destruir a
identidade da célula original.
QUESTÕES
- O que significa semear um material clinica?
- Qual principio das técnicas de semeadura?
- O que significa repicar uma cultura?
- Como se obtém uma cultura pura.
- Qual importância da cultura pura no diagnóstico de doenças infecciosas?
- Para se identificar uma
bactéria é necessário se obter uma cultura pura. Por que uma cultura
mista conduz a erros de identificação?
- Em laboratório, os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vários fatores. Cite-os.
- Por que todo processo de
semeadura deve ser feito em ambiente limpo e desinfetado, próximo de uma
chama “azul” de um bico de Bunsen, ou então dentro de uma câmara de
fluxo laminar;
- As placas semeadas devem ser
incubadas com tampa invertida para não haver transpiração do meio sobre
a tampa. O que pode ocorrer com as colônias se as placas forem
incubadas com a tampa para cima?
- Comente sobre os seguintes
métodos de conservação de bactérias: a) Liofilização, b) Congelamento,
c) Transferência periódica para novos meios, d) conservação sob camada
de óleo mineral
6. CONTROLE DE MICRORGANISMOS
6.1. Ação de Agentes Químicos e Físicos
Sobre a Microbiota Normal
Objetivos: Verificar a ação dos agentes
químicos sobre a microbiota residente nas mãos e os fatores que influenciam no
processo da assepsia das mãos. Demonstrar técnicas eficiente de assepsia
Princípio: Eliminação parcial dos microrganismos na superfície
corpórea pela ação de agentes químicos que não agridem o tecido ( detergentes,
sabão, álcool, iodo, etc) e ação mecânica da escovação.
Material: Sabão ou sabonete, escova de unhas, álcool iodado, alcool
a 70%, ágar Mueller-Hinton em placas, caldo BHI em tubos, galeria para tubos,
salina estéril, swab esteril.
Método:
1º Etapa ( AT
):
Estudo
da microbiota das mãos antes da lavagem e assepsia
Selecionar
5 voluntários da equipe e passar um
swab
estéril umedecido com salina estéril nas mãos, principalmente entre os dedos e
nas unhas. Passar o
swab sobre a
superfície da placa de ágar Mueller-Hinton, espalhando bem sobre toda a
superfície
e
em seguida colocar o
swab dentro do
tubo com caldo BHI. Incubar as placas e os tubos a 37ºC por 24 a 48 horas.
2º Etapa: Lavagem e assepsia das mãos
Os 5 voluntários da 1ª etapa devem fazer os
seguintes procedimentos:
Voluntário 1: Lavar as mãos com água e sabão como faz de costume
Voluntário
2: Lavar as mãos com água e sabão, escovando por 1 min.
Voluntário
3: Lavar as mãos com água e sabão, escovando por 1 min. e passar álcool a
70%, deixando-o agir por 1min. Enxaguar com água destilada estéril
Voluntário
4: Lavar as mãos com água e sabão, escovando por 1 min. e passar PVP-I ,
deixando-o agir por 1min. Enxaguar com água destilada estéril
Voluntário
5: Lavar as mãos com água e sabão, escovando por 1 min. e passar solução de
clorexidina, deixando-a agir por 1min. Enxaguar com água destilada estéril
3º Etapa (DT
):
Estudo
da microbiota das mãos após lavagem e assepsia
Após
a lavagem e assepsia das mãos
proceder conforme a 1 ª Etapa, utilizando os mesmos voluntários.
Interpretação: Observar crescimento bacteriano pela formação de
colônias (fazer a contagem) nas placas e turvação do caldo BHI e anotar os
resultados na tabela a seguir:
|
VOLUNTÁRIOS
|
AGENTES
|
Nº de colônias
observado no ágar Mueller-Hinton
|
Crescimento
bacteriano (turvação do caldo BHI)
|
|
1
|
Sabão
|
|
|
|
2
|
Sabão + Escovação
|
|
|
|
3
|
Sabão + Escovação +
Álcool 70%
|
|
|
|
4
|
Sabão + Escovação +
PVPI
|
|
|
|
5
|
Sabão + Escovação +
Clorexidina
|
|
|
Questões
1.
Defina os termos: Assepsia, Desinfecção, Esterilização
2.
O álcool a 70% utilizado na limpeza das mãos e na
limpeza da bancada, são respectivamente: (
) Antisséptico e Desinfetante; (
) Desinfetante e Antisséptico; (
) Somente antisséptico; ( )
Somente Desinfetante. JUSTIFIQUE A SUA RESPOSTA
3.
É possível o médico eliminar todos os microrganismos
das mãos antes de fazer uma cirurgia? Justifique a sua resposta
4.
No procedimento da assepsia das mãos utiliza-se álcool
diluído a 70%. Porque não se utiliza o álcool concentrado nestes procedimentos/
5.
Qual a importância da microbiota residente na pele?
6.
Quais os fatores que influenciam no processo da
assepsia das mãos
7.
Em sua opinião, qual a melhor recomendação para se
fazer a assepsia das mãos.
8.
Quais as possíveis fontes de contaminação das mãos na
sua vida cotidiana?
Comentários
– Assepsia/Microbiota da Pele
Define-se como
antisséptico (gr.
anti, contra e
sepsis, putrefação) toda substância capaz
de impedir a proliferação das bactérias, seja inativando-as (efeito
bacteriostático), seja destruindo-as (efeito germicida). O vocábulo deveria
restringir-se ao emprego em tecido vivos, e.g., na antissepsia das feridas, ao
contrário do termo desinfetante, reservado ao caso de substâncias inanimadas,
como na desinfecção de fômites ou excretos. Na prática porém tais conceitos nem
sempre delimitam perfeitamente, empregando-se como sinônimos a termos
antisséptico, desinfetante e germicida
.
Assepsia é o conjunto de meios usados para impedir a
penetração de germes em local que os não contenha.
A técnica
cirúrgica atual é baseada na assepsia: O cirurgião que vai intervir na cavidade
peritoneal, normalmente estéril, procura por todos os meios evitar a contaminação
do peritônio desinfetando escrupulosamente as suas próprias mãos e calçando
luvas previamente esterilizadas, fazendo assepsia da pele do paciente e
protegendo o campo operatório por meio de panos estéreis, usando instrumental,
fios de sutura esterilizados, etc.
Devido à
constante exposição e contato com o meio ambiente, a pele está particularmente
propensa a abrigar microrganismos transitórios. Todavia, dispõe de uma
microbiota residente constante e bem definida, modificada em diferentes regiões
anatômicas por secreções, uso de roupas ou proximidade de mucosas (boca, nariz,
áreas perineais, etc. ).
Os
microrganismos residentes predominantes da pele são os bacilos difteróides
aeróbios (p.ex. Corynebecterium sp., Propionibacterium); estafilococos
aeróbios não hemolíticos (Staphylococcus
epidermidis, ocasionalmente Staphylococcus
aureus); bacilos Gram-positivos, aeróbios e formadores de esporos ubíquos
no ar, na água e no solo; estreptococos alfa-hemolíticos (Streptococcus viridans) e enterococos ( Enterococcus sp. ); bacilos coliformes Gram-negativos e Acinetobacter. Com frequência
verifica-se a presença de fungos e leveduras nas pregas cutâneas; as
micobactérias não patogênicas e álcool-ácido-resistentes ocorrem em regiões
ricas em secreções sebáceas (genitália, ouvido externo).
Dentre
os fatores que podem ser importantes na eliminação de microrganismos não
residentes na pele estão o pH baixo, os ácidos graxos das secreções sebáceas e
a presença de lisozima. Nem a sudorese profusa e nem a lavagem e o banho consegue
eliminar ou modificar significantemente a microbiota residente normal. O número
de microrganismos superficiais pode ser diminuindo pela escovação vigorosa
diária com sabão contendo hexaclorofeno
ou outros desinfetantes; apesar disso, a microbiota é rapidamente
recuperada a partir das glândulas sebáceas e sudoríparas, mesmo quando o
contato com outras regiões cutâneas ou com o meio ambiente é totalmente
evitada. O uso de curativo oclusivo na pele tende a resultar em acentuado
aumento da população microbiana total e também pode produzir alterações
qualitativas na microbiota.
6.2. Ação da Rad. U.V. Sobre o crescimento
bacteriano
Objetivos: Demonstrar a
ação da radiação U.V sobre o crescimento bacteriano
Princípio: Propriedade da luz ultravioleta de agir sobre a bactéria
inibindo o seu crescimento pela ação a nível de DNA, onde propicia a formação
de dímeros de timina que interferem no mecanismo de replicação, transcrição e
tradução de informações genéticas.
Material: Suspensão de bactérias em salina
(
E.coli, S.aureus, etc.), ágar
Mueller-Hinton em placas,
swab
estéril, álcool comercial, becker de 250ml, bico de Bunsen,
Método: Introduzir o
swab estéril no tubo contendo a suspensão bacteriana, retirar o excesso e
espalhar uniformente sobre toda superfície das 5 placas contendo ágar
Mueller-Hinton. Expor as placas a radiação U.V., conforme o esquema abaixo:
Placa 1:
não expor à radiação U.V (CONTROLE)
Placa 2:
Expor à radiação U.V por 10 seg.
Placa 3:
Expor à radiação U.V por 30 seg.
Placa 4:
Expor à radiação U.V por 60 seg.
Placa 5:
Expor à radiação U.V por 180 seg.
Incubar
todas as placas na estufa a 37ºC por 24 a 48horas
Interpretação: Observar a
formação de colônias em todas as placas e averiguar onde ocorreu maior e menor
crescimento. Se possível determinar o nº de colônias em cada placa e percentagem de inibição em função da placa
controle.
Questões
·
Comente o significado da frase: “Ao sair da área
de radiação, as placas devem ser colocadas em lugar escuro para evitar a
fotoreação”.
·
De que forma podemos demonstrar que a radiação
U.V. não ultrapassa o vidro?
·
Qual o mecanismo de ação da radiação U.V. sobre
a célula bacteriana?
·
Quais os fatores que interferem no processo de
esterilização por radiação U.V?
·
Em que circunstâncias se deve utilizar a
radiação U.V. para proceder a esterilização de um material ou produto?
·
Quais as vantagens e desvantagens da
esterilização por U.V. sobre outros processos físicos?
